生物制藥生產(chǎn)商對內(nèi)毒素有兩個擔憂。首先，注射成品中的內(nèi)毒素含量必須低于內(nèi)毒素限值。這一問題適用于所有注射藥物、生物制品和無熱原醫(yī)療器械。這方面的文獻記載很多，本文不再討論。第二個問題是內(nèi)毒素對用于生產(chǎn)生物制藥的表達系統(tǒng)和產(chǎn)品本身的影響。

內(nèi)毒素對不同細胞類型或細胞系的影響差別很大。我們應該了解內(nèi)毒素對相關細胞的影響，以便采取適當?shù)目刂拼胧?/span>。即使是母細胞系和子細胞系，對內(nèi)毒素的敏感性也可能大相徑庭。1對所用的細胞表面受體的認識可以提醒研究者注意潛在的內(nèi)毒素敏感性。人體細胞上的CD14受體與內(nèi)毒素敏感性密切相關。2當培養(yǎng)基中含有血清時，這一點尤為重要。血清成分，如脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）和septin復合物，可增強CD14細胞對內(nèi)毒素的激活作用。3,4相反，一些哺乳動物和脊椎動物的細胞系統(tǒng)對內(nèi)毒素具有耐受性。細菌和酵母培養(yǎng)基中內(nèi)毒素的存在通常不是一個問題。下文將舉例說明內(nèi)毒素對生物系統(tǒng)的影響。

在涉及細胞培養(yǎng)的研究中，必須防止因生物對污染物的反應而產(chǎn)生的虛假結(jié)果。此外，還必須將產(chǎn)物的特性與污染物內(nèi)毒素的特性區(qū)分開來，細胞因子尤其如此。

一、膜和形態(tài)學效應

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的兩親性膜成分。它可能會干擾其他細胞的膜結(jié)構(gòu)和功能，這并不奇怪。內(nèi)毒素通過磷酸基團與陽離子蛋白質(zhì)發(fā)生反應，其脂肪酸鏈則與脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)的親水區(qū)發(fā)生作用。內(nèi)毒素與細胞膜的相互作用可能表現(xiàn)為明顯的形態(tài)學變化，如中國倉鼠卵巢細胞膜紊亂、5表面褶皺和細胞器增多、6細胞質(zhì)中出現(xiàn)大液泡、7形態(tài)學損傷和己糖攝取減少、8和嚴重的膜損傷。9有時形態(tài)變化暴露于清潔介質(zhì)后是可逆的。10此外，不同的內(nèi)毒素對形態(tài)學的影響也不同。11

情況嚴重的話，內(nèi)毒素對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的影響可能具有細胞毒性。不同內(nèi)毒素12和不同細胞系之間的毒性程度各不相同。13然而，至少有一些細胞可能誘導對內(nèi)毒素的耐受性。14

二、分泌/生產(chǎn)

細胞膜對細胞產(chǎn)物的合成至關重要，內(nèi)毒素會影響這一合成過程。這顯然是細胞研究和商業(yè)細胞系開發(fā)的關鍵問題。細胞的敏感性是多種多樣的；例如，從內(nèi)毒素反應親本中克隆了兩種無反應的T細胞系。15此外，內(nèi)毒素的反應可能會受到其他因素的影響，如溫度。16

內(nèi)毒素對體外單細胞產(chǎn)生細胞因子的影響已被廣泛報道。內(nèi)毒素被認為是腫瘤壞死因子（TNF）產(chǎn)生的有效刺激物。17已經(jīng)注意到對轉(zhuǎn)錄的影響，18,19,20,21并且已經(jīng)提出刺激的主要調(diào)節(jié)可能發(fā)生在這個水平上。22

除細胞因子外，一系列細胞產(chǎn)物也受到內(nèi)毒素的影響。哺乳動物細胞合成受到刺激或增強的產(chǎn)物包括前列腺素、23酸性磷酸酶、6纖維蛋白溶解抑制劑、24膠原酶生成、25神經(jīng)生長因子、26B因子分泌、27多肽、28血小板激活因子、29粘附抑制劑、30粘附分子-131和促凝劑（劑量依賴性）。

已觀察到內(nèi)毒素對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性33、蛋白多糖23和α2 巨球蛋白34的合成有抑制作用。這些反應可能與劑量有關，在某些情況下，不同的內(nèi)毒素會產(chǎn)生不同的反應。例如，在某些劑量下，乳桿菌內(nèi)毒素會刺激磷酸酶的產(chǎn)生，而大腸桿菌內(nèi)毒素則會抑制磷酸酶的產(chǎn)生。11

三、有絲分裂

內(nèi)毒素對某些哺乳動物細胞類型和品系具有強烈的有絲分裂作用。這種效應會給易感細胞的培養(yǎng)帶來問題。另一方面，一些歷史悠久的細胞系對培養(yǎng)基中的高濃度內(nèi)毒素具有耐受性。有報道稱，有絲分裂性與幾種不同內(nèi)毒素的LAL反應性和熱原性之間存在相關性。35然而，正相關性并不總是很明顯，同樣有絲分裂性的內(nèi)毒素在LAL反應性和熱原性方面可能存在顯著差異。36因此，LAL活性不是內(nèi)毒素有絲分裂性的良好預測指標。37

一些有絲分裂原受到內(nèi)毒素的嚴重污染（表1），其高濃度使人懷疑內(nèi)毒素對其有絲分裂作用的影響。有報道稱，內(nèi)毒素和有絲分裂的作用具有相似性。38

Concanavalin A（刀豆凝集素A ）

Pokeweed mitogen（美洲商陸有絲分裂原）

表1.兩種有絲分裂原種的內(nèi)毒素濃度39

更為復雜的是，內(nèi)毒素可以抑制細胞分裂，與刺激有絲分裂一樣，這些作用取決于內(nèi)毒素的來源。40可能存在濃度依賴性效應，從促進有絲分裂到抑制更高濃度的有絲分裂。值得注意的是，一些常用有絲分裂中的內(nèi)毒素濃度與某些細胞系中抑制細胞分裂的內(nèi)毒素濃度一樣高。

四、其他影響

文獻中報道的內(nèi)毒素對其他體外細胞的其他影響包括：影響粘附性、41胰島素結(jié)合和內(nèi)吞作用的減少、42TNF結(jié)合位點的喪失、43保護細胞免受HIV感染、44殺瘤活性45以及鉀電流和鉀通道數(shù)量的增加。46

五、多重效應和協(xié)同作用

內(nèi)毒素引起的多種生物反應可能造成因果關系的混亂。內(nèi)毒素對細胞產(chǎn)物分泌的影響可能是間接的。例如，干擾素抗體可阻止內(nèi)毒素對彈性蛋白酶分泌的明顯抑制作用。這表明細胞產(chǎn)生的干擾素導致了抑制作用。在抗體存在的情況下，內(nèi)毒素實際上增加了彈性蛋白酶的分泌。因此，抑制作用是繼發(fā)性的，是由于內(nèi)毒素刺激了干擾素的產(chǎn)生。47

同樣，培養(yǎng)的心臟細胞產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)生80%的抑制作用是由細胞產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導的TNF介導的。48這些觀察結(jié)果是一個明確的警告，觀察到的影響可能是內(nèi)毒素暴露的間接后果。類似地，有絲分裂性可能是次要效應。內(nèi)毒素刺激巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生IL-1已被證明在脾臟細胞中有致裂作用。49在這種情況下，這種作用是由牙齦擬桿菌的內(nèi)毒素引起的，而不是由腸道細菌引起的。淋巴因子和內(nèi)毒素之間有趣的協(xié)同作用可誘導巨噬細胞產(chǎn)生化學發(fā)光，這種反應已被建議作為細胞毒性試驗的替代品。50

在另一項研究中，內(nèi)毒素與細胞因子在同一系統(tǒng)中既有協(xié)同作用，也有拮抗作用。51粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子使細胞對內(nèi)毒素產(chǎn)生反應，從而誘導TNF的產(chǎn)生。TNF刺激lL-6的產(chǎn)生，從而在負反饋循環(huán)中抑制TNF的進一步產(chǎn)生。

六、體外受精

體外受精是組織培養(yǎng)技術的一種特殊應用。在低內(nèi)毒素濃度的培養(yǎng)基中可以提高受精率。52在培養(yǎng)基中檢測不到內(nèi)毒素的情況下（檢測限為0.1ng/ml），懷孕率為27.2%，而在含有內(nèi)毒素的情況下，懷孕率僅為6.3%。內(nèi)毒素存在時，形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。在另一項研究中，53在內(nèi)毒素濃度高于1ng/ml時，觀察到孕體中碎片的程度不斷增加。當內(nèi)毒素濃度低于1ng/ml時，卵母細胞受精率為66%，而當內(nèi)毒素濃度大于1ng/ml的時候，受精率為53%。比較妊娠情況時，差異更為明顯。當培養(yǎng)基中內(nèi)毒素濃度超過1ng/ml時，妊娠率為8%，未檢測到內(nèi)毒素（0.1ng/ml）時，妊娠率為32%。

七、結(jié)論

由于細胞對內(nèi)毒素的反應千差萬別，因此無法確定內(nèi)毒素開始干擾細胞功能和生長的臨界水平，也不可能說明這種干擾可能采取的形式。內(nèi)毒素的影響和所討論的細胞的敏感性只能通過在沒有可檢測到的內(nèi)毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來確定。這可能可行，也可能不可行。如果可行，可以確定臨界污染水平并設定限制。

人們早已認識到內(nèi)毒素對細胞過程的影響。由于血清在細胞培養(yǎng)基中的廣泛使用54，人們對血清的內(nèi)毒素污染給予了特別關注。Fumarola和Jirillo55,56強烈呼吁人們認識到內(nèi)毒素對細胞系的影響，以及適當降低內(nèi)毒素濃度的必要性。他們指出，“生物學中常用的一些制劑受到內(nèi)毒素污染，可能會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。"至少有一種說法認為組織培養(yǎng)基中“絕對不存在"內(nèi)毒素。57這些作者還討論了使用內(nèi)毒素刺激細胞并提高其反應性的問題，但顯然是以受控的方式。

應盡量減少產(chǎn)品的內(nèi)毒素污染，而不僅僅是因為擔心熱原性和內(nèi)毒素限值。一些生物技術產(chǎn)品的特性是與內(nèi)毒素相同的。58如果制劑被內(nèi)毒素污染，就無法對這些產(chǎn)品進行適當評估。研究人員使用End-X B15內(nèi)毒素親和樹脂（美國ACC）的經(jīng)驗很好地說明了這一點。從蛋白質(zhì)溶液中成功地去除了內(nèi)毒素，遠低于令人擔憂的水平，該蛋白質(zhì)的特異酶活性不受處理的影響。然而，該制劑的有絲分裂活性卻急劇下降。研究人員最終得出結(jié)論，原始制劑的有絲分裂性可能是由于大量內(nèi)毒素污染造成的，而不是蛋白質(zhì)的固有特性。

內(nèi)毒素污染的問題應該在產(chǎn)品開發(fā)的早期解決，當然也應該在擴大規(guī)模之前解決。這樣既能最大限度地減少有害影響，又能正確確定產(chǎn)品的特性，對內(nèi)毒素相關問題的及早關注可能會持續(xù)到全面生產(chǎn)。當內(nèi)毒素規(guī)范對生物制藥和傳統(tǒng)生產(chǎn)的治療方法同樣重要時，這將有利于最終釋放測試。

參考文獻